Plama Ziehla-Neelsena: Foundation, Reagents and Technique

Barwienie Ziehlem-Neelsenem w technice barwienia w celu identyfikacji mikroorganizmów odpornych na działanie kwasu (AAR). Nazwa tej procedury mikrobiologicznej odnosi się do jej autorów: bakteriologa Franza Ziehla i patologa Friedricha Neelsena.

Ta technika jest rodzajem zróżnicowanego zabarwienia, co oznacza użycie różnych barwników w celu stworzenia kontrastu między strukturami, które chcesz obserwować, różnicować i później identyfikować. Barwienie Ziehl-Neelsen służy do identyfikacji niektórych rodzajów mikroorganizmów.

Niektóre z tych mikroorganizmów to prątki (na przykład Mycobacterium tuberculosis ), nocardia (na przykład Nocardia sp.) Oraz niektóre jednokomórkowe pasożyty (na przykład Cryptosporidium parvum ). Wiele bakterii można sklasyfikować za pomocą powszechnej techniki zwanej barwieniem metodą Grama.

Jednak niektóre grupy bakteryjne wymagają innych metod ich identyfikacji. Techniki takie jak barwienie Ziehlem-Neelsenem wymagają kombinacji barwników z ciepłem, aby przymocować pierwsze do ściany komórkowej.

Następnie następuje proces przebarwienia, który pozwala na uzyskanie dwóch wyników: odporności lub wrażliwości na przebarwienia przez kwasy i alkohole.

Fundacja

Podstawą tej techniki barwienia są właściwości ścian komórkowych tych mikroorganizmów. Ściana jest utworzona przez rodzaj kwasów tłuszczowych zwanych kwasami mikolowymi; Charakteryzują się one bardzo długimi łańcuchami.

Gdy kwasy tłuszczowe mają bardzo długie struktury, mogą łatwiej zatrzymywać barwniki. Niektóre rodzaje bakterii są bardzo trudne do wybarwienia metodą barwienia metodą Grama, ze względu na wysoką zawartość kwasu mikolowego w ścianie komórkowej.

W barwieniu Ziehla-Neelsena stosuje się związek fenolowy Carbol Fuchsin, podstawowy barwnik. Ma to zdolność do interakcji z kwasami tłuszczowymi w ścianie komórkowej, która ma teksturę woskową w temperaturze pokojowej.

Barwa fuksyny karbolu ulega poprawie w obecności ciepła, ponieważ wosk topi się, a cząsteczki barwnika szybciej przemieszczają się do ściany komórkowej.

Stosowany później kwas służy do odbarwiania komórek, które nie były zabarwione, ponieważ ich ściana nie była wystarczająco związana z barwnikiem; dlatego też siła odbarwiającego kwasu jest zdolna do usuwania barwnika kwasowego. Komórki, które są odporne na takie przebarwienia, nazywane są kwasoodpornymi.

Kolorystyka wtórna

Po przebarwieniu próbki kontrastuje to z innym barwnikiem zwanym barwnikiem wtórnym. Zazwyczaj stosuje się błękit metylenowy lub zieleń malachitową.

Drugorzędny barwnik plami materiał tła, aw konsekwencji tworzy kontrast ze strukturami, które zostały zabarwione w pierwszym etapie. Tylko wybielone komórki absorbują drugi barwnik (anty-barwienie) i przyjmują kolor, podczas gdy komórki kwasoodporne zachowują kolor czerwony.

Procedura ta jest często stosowana do identyfikacji Mycobacterium tuberculosis i Mycobacterium leprae, które nazywane są prątkami kwasoodpornymi.

Odczynniki

Kolorystyka pierwotna

Używa się 0, 3% karboksyny (filtrowanej). Barwnik ten wytwarza się z mieszaniny alkoholi: fenolu w etanolu (90%) lub metanolu (95%) iw tej mieszaninie rozpuszcza się 3 gramy zasadowej fuksyny.

Roztwór odbarwiający

W tym etapie można stosować roztwory 3% kwasu alkoholowego lub 25% kwasu siarkowego.

Barwienie wtórne (anty-barwnik)

Barwnik najczęściej stosowany do wykonywania kontrastu w próbkach wynosi zazwyczaj 0, 3% błękitu metylenowego. Jednakże można również użyć innych, takich jak 0, 5% malachitowej zieleni.

Technika

Procedura barwienia szybko kwasowego

Przygotuj rozmaz bakteryjny

Ten preparat odbywa się na czystym i suchym szkiełku, zgodnie z zasadami bezpieczeństwa sterylności.

Suszenie rozmazu

Pozostaw rozmaz do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.

Podgrzać próbkę

Próbkę należy ogrzać, stosując ogień na slajdzie poniżej. Fiksacja alkoholem może być przeprowadzona, gdy rozmaz nie został przygotowany plwociną (traktowaną podchlorynem sodu w celu jego wybielenia) i jeśli nie zostanie natychmiast zabarwiony.

M. tuberculosis jest eliminowana przez wybielacz i podczas procesu barwienia. Termostabilizacja nieleczonej plwociny nie zabije M. tuberculosis, podczas gdy fiksacja alkoholem jest bakteriobójcza.

Zakryj plamę

Bejca jest pokryta roztworem fuksyny karbolu (podstawowy podstawowy barwnik).

Podgrzej plamę

Robi się to przez 5 minut. Powinieneś zauważyć uwolnienie pary (około 60 ° C). Ważne jest, aby nie przegrzewać i unikać spalania próbki.

W odniesieniu do ocieplenia plamy, należy zachować szczególną ostrożność podczas ogrzewania fuksyny karbolowej, zwłaszcza jeśli barwienie przeprowadza się na tacy lub innym pojemniku, w którym z poprzedniej plamy zebrano wysoce łatwopalne substancje chemiczne.

Pod szkiełkami należy nakładać tylko mały płomień za pomocą zapalonego wacika uprzednio zwilżonego kilkoma kroplami kwaśnego alkoholu, metanolu lub 70% etanolu. Unikaj używania dużego wacika nasączonego etanolem, ponieważ jest to zagrożenie pożarowe.

Umyj plamę

To mycie należy wykonywać czystą wodą. Jeśli woda z kranu nie jest czysta, wymyj rozmaz, najlepiej wodą filtrowaną lub destylowaną.

Zakryj rozmaz kwaśnym alkoholem

Ten kwaśny alkohol powinien wynosić 3%. Pokrycie przeprowadza się przez 5 minut lub do momentu, gdy rozmaz jest wystarczająco odbarwiony, to znaczy bladego różu.

Należy wziąć pod uwagę, że alkohol kwaśny jest łatwopalny; dlatego należy go używać bardzo ostrożnie. Unikaj przebywania w pobliżu źródeł zapłonu.

Umyj plamę

Mycie powinno odbywać się czystą, destylowaną wodą.

Przykryj rozmaz barwnikiem

Może to być barwnik zielony malachit (0, 5%) lub błękit metylenowy (0, 3%) przez 1 lub 2 minuty, przy użyciu najdłuższego czasu, jeśli rozmaz jest cienki.

Umyj plamę

Czysta woda musi być ponownie użyta (destylowana).

Opróżnij

Tył prowadnicy należy oczyścić, a plamę umieścić na półce drenażowej, aby wyschła na powietrzu (nie należy używać chłonnego papieru do suszenia).

Zbadaj rozmaz w mikroskopie

Należy użyć obiektywu 100X i oleju immersyjnego. Systematycznie skanuj rozmaz i zapisz odpowiednie obserwacje.

Zinterpretuj wyniki

Teoretycznie mikroorganizmy zabarwione na czerwono są uważane za kwasooporne (AAR +).

Przeciwnie, jeśli mikroorganizmy są zabarwione na niebiesko lub zielono, w zależności od barwnika użytego jako przeciw-barwnik, są one uważane za ujemny kwas odporny na alkohol (AAR-).